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差示扫描荧光法DSF的介绍及其在蛋白质稳定性筛选等方面的应用
浏览次数：4738 发布日期：2025-1-22
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前言
蛋白质涉及生理的方方面面，要正确地发挥其作用，它们需要以特定的方式折叠。这些大分子的结构和稳定性是保持其活性和功能的重要因素。保持蛋白质结构的稳定状态对于药物开发、给药和基础研究至关重要。蛋白质的结构稳定性与环境条件和缓冲液配方直接相关，不同蛋白质的环境条件和缓冲液配方各不相同。这些因素与蛋白质结构和氨基酸序列有关，决定了蛋白质的紧密程度以及等电点（pI）等。此后，这些参数通过定义最佳pH值、离子和温度来确定最佳储存条件。
应研究蛋白质在不同条件和不同添加剂下的结构，以便深入了解其功能并优化条件。这对生物制剂尤为重要。蛋白质工程有助于蛋白质治疗，根据分子类型进行分类，其中规模最大、增长最快的是抗体药物。在这一类蛋白质中，单克隆抗体（mAbs）正受到各大制药和生物技术公司的关注。大多数mAb多肽链可以折叠成特定形状，这对蛋白质的功能性和稳定性至关重要。保持和提供形状正确的mAb是制药研发部门的主要重点之一，这不仅与蛋白质的稳定性有关，还与蛋白质的聚集倾向有关。
差示扫描荧光法（DSF）介绍
差示扫描荧光法（Differential Scanning Fluorimetry，DSF），又称热迁移分析（Thermal Shift Assay，TSA）或ThermoFluor，是一种成本效益高、可并行化、实用且易于使用的生物物理技术（图1）。因此，它被广泛用作跟踪蛋白质折叠状态和稳定性以及相互作用等研究。传统的DSF使用实时荧光定量PCR仪，通过测量优先与未折叠蛋白质结合的染料（如SYPRO Orange，它与蛋白质因折叠而暴露的疏水区域结合）的荧光变化来监测热诱导的蛋白质变性。该实验也被称为蛋白质热迁移分析，因为在加入稳定或不稳定的结合配体或缓冲成分后，可以测量表观熔解温度（Tm）的变化。在有特定化合物或配体结合的情况下，蛋白稳定性的上升，表现为熔解温度的上升。
图1：使用外部荧光染料的典型蛋白质热稳定性分析数据。(A) 温度的升高将蛋白质推向未折叠状态，50%的蛋白质样品处于折叠状态和50%处于未折叠状态的温度被定义为熔解温度（Tm），对应的荧光强度达到最大荧光值的一半；随着温度进一步升高，蛋白质最终聚集而使染料解离，荧光强度降低。(B) 为提高可视化程度，还可将数据绘制成荧光曲线（dF/dT）与温度的对比斜率图。Tm显示为一个峰值，ΔTm可以通过配体结合蛋白（红色）和非结合蛋白（黑色）的峰值之间的距离得到。
与大多数其他方法相比，DSF的速度很快（20-120分钟）。它还可用于多种用途，例如，确定纯化重组蛋白的稳定条件、添加剂和小分子配体以及辅助因子。收集到的数据可直接用于研究蛋白质的特性，也可用于指示有利的结晶或储存条件，或帮助确定功能。DSF的高通量特性允许通过对各种溶液条件（如缓冲液特性、溶液pH值和离子强度）进行稀疏基质筛选，快速发现蛋白质稳定溶液。通常，DSF检测在96孔板或384孔板中以20 µL的体积进行，最终体积中含有5-10 µM的蛋白质。鉴于这些优点，DSF被广泛应用于学术界、政府和工业界的实验室。
差示扫描荧光法（DSF）应用
蛋白质稳定性筛选
▪ 改进蛋白质预处理（缓冲液pH值、盐、辅料、添加剂）
▪ 分析结晶条件
▪ 蛋白质配方和储存缓冲液优化
▪ 突变或修饰对蛋白质稳定性的影响
▪ 蛋白质制备质量控制（是否存在杂质或聚集蛋白质）
高通量配体筛选
▪ 小分子和片段库筛选
▪ 抗体-靶标特异性
▪ 蛋白质-蛋白质相互作用
▪ 抑制剂结合
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