蜱隶属于节肢动物门（Athropoda）蛛形纲（Arachnida）蜱螨亚纲（Acari）寄螨目（Parasitiformes）蜱总科（Ixodoidea），全世界已知蜱类3科18属895种，中国记载的有2科10属117种，约占世界蜱种的13%[1]。蜱作为一类专性寄生的吸血节肢动物，除吸血造成宿主损伤外，还可传播100余种病原体（如病毒、立克次体、细菌、螺旋体和原虫等），是仅次于蚊类的极其重要的人类和动物疾病的传播媒介或贮藏宿主，具有重要的公共卫生意义[2]。蜱也是我国近年来多种新发传染病的传播媒介，如2009年发现的发热伴血小板减少综合征，长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）被证实是其病原体的传播媒介[3]。蜱传播疾病的流行特征与其种群的地理分布、生态条件及生物学特点有关，对蜱种群分布研究是控制蜱媒传染病传播流行的必要环节。为更好地认识蜱的生物学特性，方便开展病原学研究，为疾病的预防控制提供依据，本课题组在浙江省8个县（市、区）开展了蜱种群分布调查，2018年在其中3个县（区）采集的蜱标本中发现硬蜱科血蜱属一新纪录种，现就新纪录种鉴定过程报告如下。
1 材料与方法
1.1 蜱标本来源 2018年3－10月在浙江省台州市椒江区、临海市，舟山市岱山县、定海区，湖州市安吉县，金华市浦江县，温州市平阳县和丽水市景宁畲族自治县发热伴血小板减少综合征监测点采集的蜱样本，主要采自草丛、灌木丛及家养动物羊、牛、犬等动物体表，采集蜱放入统一编号的采集管中带回实验室进行形态学鉴定，新纪录种开展分子生物学鉴定。
1.2 形态学鉴定 通过体视显微镜（KEYENCE VHX-6000）观察待检蜱的形态结构，记录假头基、盾板、须肢、口下板、肛沟、内距、生殖孔等特征，参照蜱分类检索表进行初步形态学鉴定[4]。
1.3 蜱基因组DNA的提取 待检蜱用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次，匀浆，使用天根DNA/RNA共提试剂盒（天根生化科技有限公司）提取样品DNA。
1.4 线粒体16S rRNA基因和细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因扩增与测序 以提取的蜱基因组为模板，使用正向引物5′-CTGCTCAATGATTTTTTA AATTGCTG TGG-3′，反向引物5′-CCGGTCTGAA CTCAGATCAAGT-3′对线粒体16S rRNA基因进行扩增，扩增条件为：94 ℃ 7 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，40个循环；72 ℃延伸8 min[5-6]。以引物LCO1490 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，HCO2198 5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAATCA- 3′对线粒体COⅠ基因进行扩增，扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，40个循环；72 ℃延伸10 min[7-8]。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将目的基因片段送至杭州有康生物科技有限公司进行测序。
1.5 同源性分析 将测得的核苷酸序列用DNAStar Lasergene（v7.1.0）软件的SeqMan程序进行编辑，再利用MegAlign程序进行同源性比较，用于比较分析的相关蜱线粒体16S rRNA基因和COⅠ基因序列来自GenBank数据库（表 1）。
表 1 用于16S rRNA和COⅠ基因同源性分析的序列及来源
Table 1 Sequences for 16S rRNA and COⅠ gene homology analysis and their source
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2 结果
2.1 蜱监测概况 2018年浙江省采集到的蜱经形态学鉴定主要为长角血蜱、中华硬蜱（Ixodes sinensis）、镰形扇头蜱（Rhipicephalus haemaphysaloides）、血红扇头蜱（R. sanguineus）和微小扇头蜱（R. microplus）。从椒江、安吉、浦江等地采集的蜱中发现浙江省硬蜱科血蜱属一新纪录种。采集到的该新纪录种均为雄蜱，共计13只（安吉县11只、椒江区和浦江县各1只），选取1只开展详细的形态学和分子生物学鉴定。
2.2 形态学鉴定结果 待检蜱（图 1）为饥饿雄蜱，长约2.2 mm，宽约1.4 mm，体色暗黄。假头基呈矩形，基突发达。须肢宽短，须肢第2节腹面内缘刚毛3根；须肢第3节宽短，腹刺粗短，末端约达第2节前缘。口下板粗短，齿式约5/5。盾板卵圆形，无色斑，长约为宽的1.5倍；颈沟短浅；侧沟短，自盾板的中部后伸，末端达第一缘垛前角和气门板后缘。肛沟围绕在肛门之后，缘垛明显。足基节Ⅰ内距粗短，末端钝；基节Ⅱ、Ⅲ内距近似三角形，末端尖；基节Ⅳ内距显著长，末端尖细。爪垫约达爪长的2/3。基于上述形态结构特点，对照文献初步认定为褐黄血蜱（H. flava）。
注：A.背面形态；B.腹面形态；C.爪垫；D.内距。
图 1 浙江省采集的褐黄血蜱（雄）形态学特征
Figure 1 Morphological features of Haemaphysalis flava (male) collected in Zhejiang province, China
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2.3 16S rRNA基因和COⅠ基因序列同源性分析 该血蜱16S rRNA基因片段长度约为405 bp（GenBank登录号：MN650207），与已知褐黄血蜱（河南，KX450282.1）线粒体16S rRNA基因片段匹配度达100%，MegAlign分析结果显示序列的保守性和分歧度差异较大（表 2），待检蜱16S rRNA序列与其他血蜱属的同源性在86.9%~92.2%，分歧度在8.2%~14.7%之间；与革蜱属、扇头蜱属、璃眼蜱属、花蜱属和硬蜱属的同源性不超过84.7%。
表 2 浙江省待检蜱与其他蜱种16S rRNA基因同源性和分歧度（%）
Table 2 Homology and divergence (%) of the 16S rRNA genes between the ticks to be identified in Zhejiang province, China and other tick species
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该血蜱COⅠ基因片段长度约为658 bp（GenBank登录号：MN650208），与已知褐黄血蜱（湖南，KJ195464.1）线粒体COⅠ基因片段匹配度达99.8%。MegAlign分析结果显示待检血蜱COⅠ基因片段序列的保守性和分歧度差异较大（表 3），与其他血蜱属的同源性在84.7%~90.7%，分歧度在10.0%~17.2%之间；与革蜱属、璃眼蜱属、扇头蜱属、硬蜱属和花蜱属的同源性均不超过84.8%。
表 3 浙江省待检蜱与其他蜱种COⅠ基因同源性和分歧度（%）
Table 3 Homology and divergence (%) of the COⅠgenes between the ticks to be identified in Zhejiang province, China and other tick species
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3 讨论 本研究基于形态学和分子生物学鉴定明确该蜱为褐黄血蜱。国内外已有该种记录，国外主要分布在日本、韩国、俄罗斯、印度、斯里兰卡、越南；国内主要分布于吉林、山东、甘肃、江苏、湖北、湖南、四川、台湾、贵州、江西、河南、山西、广东、广西、海南和上海等地，地理分布广泛，但浙江省为首次报告[1, 4, 9-11]。研究表明，褐黄血蜱常生活于混交林带或野地，主要寄生在猪、猪獾、犬、黄牛、马、山羊、绵羊等大型哺乳动物，也在刺猬、锦鸡、候鸟体表发现褐黄血蜱寄生的现象[11-13]，说明褐黄血蜱的宿主动物范围广。浙江省该新纪录标本采自台州市椒江区海岛以及湖州市安吉县和金华市浦江县一带的丘陵地区，主要从家养动物羊、犬体表及草丛捕获，该褐黄血蜱生境及寄生宿主符合国内外褐黄血蜱的相关报道。
传统的形态学鉴定方法要求研究人员具备丰富的媒介动物知识及现场工作经验；硬件设备要求较高，某些分类特征需借助高倍解剖镜进行观察；形态学特征相似的蜱种、标本不完整、缺乏未成熟蜱的性状描述或采集的标本为饱血个体等因素常影响形态学鉴定的准确性。近年来，基于物种相对保守基因（如12S rRNA、16S rRNA、COⅠ基因、ITS2基因等）建立的DNA条形码技术也应用到蜱的系统分类学研究中[14-19]。与传统形态学相比，分子生物学鉴定技术突破了传统方法对经验的过度依赖，并可利用蜱的残体、非成虫虫态进行有效的鉴定[20]，对形态近似种或外来蜱种进行快速准确辨别，同时条形码数据库提供的大量遗传信息可为蜱的种群研究及系统进化分析提供有效途径[19]。本研究中对浙江省该血蜱属的形态学鉴定结果与分子生物学方法鉴定结果一致，而且配合使用16S rRNA和COⅠ2种线粒体基因标记，鉴定结果更加精确。
目前对蜱的分类体系存在不同的意见，分子生物学特征在蜱类系统分类学中的应用解决了很多形态学特征无法阐明的问题，与传统形态学方法相结合更有助于建立自然、客观的系统分类体系，但这将是一个长期艰巨的任务。我国在此方面的工作还较欠缺，GenBank数据库中国学者提交的国内蜱的分子生物学标记序列较少，如缺乏分子生物学证据证实某些种的分类是否有效，不利于我国蜱种类完全准确的统计及对蜱类的种群进化研究。因此，今后在开展蜱形态学分类的同时，更应开展蜱的分子生物学分类研究，在探索我国蜱的生物学多样性、进化关系的同时，也有助于查清蜱所携带的病原体，为新发蜱传疾病的防控提供依据。